- 公司動態
水生所研究人員在衣藻中建立人工miRNA基因敲降技術平臺
2014-08-26 08:17:18衣藻是一種單細胞真核綠藻,它是進行光合作用、鞭毛/纖毛及生物能源等領域研究的模式生物。近年來,衣藻還用來表達抗體和疫苗,在生物醫學研究方面也得到越來越多的重視。由于衣藻同源重組發生的頻率低,反向遺傳學的研究主要依賴于siRNA和人工miRNA技術,其中人工miRNA技術具有特異性強、效率高等優點,一直是研究的重點。但傳統的人工miRNA表達載體具有構建費用高、操作繁瑣、篩選困難、干擾程度有限等缺點,限制了本技術的廣泛應用。 中國科學院水生生物研究所研究人員在萊茵衣藻中建立了一套利用人工miRNA敲除基因的技術平臺。該技術利用衣藻內源miRNA前體做為骨架,針對葉綠體相關基因VIPP1和鞭毛基因CDPK3分別構建人工miRNA,采用8條引物退火合成人工miRNA前體的一步構建法和熒光素酶基因融合表達的方法,實現快速構建和篩選的目的。具有操作簡單、成本低、篩選高效等優點。主要實驗結果如下:(1)通過一步法退火合成人工miRNA前體結構,并將熒光素酶基因和一步法合成的人工miRNA前體結構融合于PsaD啟動子下游共表達。通過檢測熒光素酶活性或利用Photo counting 相機直接成像,快速篩選靶基因敲降克隆。靶蛋白VIPP1可下降至野生型的22-74%。(2)人工miRNA干擾效果會隨時間減弱,篩選到的陽性克隆在*月的干擾效果*好。(3)通過在熒光素酶基因和人工miRNA前體之間融合入內源基因RBCS2的內含子1或內含子3,明顯增強了熒光素酶活性和人工miRNA的干擾效果。較未加內含子的陽性克隆,熒光素酶活性分別增強至333%或401%,而靶蛋白VIPP1含量也比野生型下降至5%或3%。將內含子3融合入靶基因為CDPK3的人工miRNA載體中,也可使靶蛋白CDPK3下降至野生型的5%。(4)誘導型NIT1啟動子在人工miRNA表達載體中同樣適用,通過更換培養基中氮源為氨基鹽或硝酸鹽,從而抑制或誘導干擾載體的表達。
-
產品搜索
留 言
- 聯系人:夏經理
- 電 話:187-2160-6967
- 手 機:18721606967
- 郵 編:201202
- 地 址:上海浦江高科技園區漕河涇開發區
- 網 址: https://shjipad.cn.goepe.com/
http://m.cxmmw.cn
電子樣本