常用蛋白濃度測(cè)定方法的比較
蛋白濃度測(cè)定方法有很多種，各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定的研究也屢見(jiàn)報(bào)道。每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性，在蛋白質(zhì)樣品中往往會(huì)含有一些化學(xué)試劑，有些化學(xué)試劑會(huì)干擾蛋白濃度測(cè)定。因此，尋找合適的實(shí)驗(yàn)方法以避免干擾對(duì)蛋白濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。基于Lowry法在測(cè)定PEG_IL_6樣品時(shí)出現(xiàn)大量黃綠色沉淀，尿素對(duì)BCA法測(cè)定蛋白濃度測(cè)定有嚴(yán)重干擾，影響結(jié)果準(zhǔn)確性，我們?cè)囼?yàn)了另外兩種方法，并進(jìn)一步對(duì)方法進(jìn)行了比較分析。
1 材料
Folin酚試劑、考馬斯亮藍(lán)G_250及4，4-二羧酸-2，2-二喹啉(BCA)均為Sigma公司產(chǎn)品；總蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自上海生物制品研究所；變性液為大腸桿菌破碎后加入β一巰基乙醇處理的樣品；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
2 方 法
Lowry法操作參考文獻(xiàn)[4]。磺基水楊酸沉淀法操作參考文獻(xiàn)[5]。Bradford法操作參考文獻(xiàn)[6]，為方便試驗(yàn)稍作改變，即取0～500 gg／mL的樣品100 L加Bradford試劑2 mL，室溫放置5 min在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。
3 結(jié) 果
3．1 測(cè)定原理比較
Lowry法的測(cè)定原理為蛋白質(zhì)與堿性硫酸銅作用形成銅-肽鍵絡(luò)合物，后者與色氨酸和酪氨酸共同作用使酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸還原生成藍(lán)色化合物；BCA法的測(cè)定原理為蛋白質(zhì)價(jià)銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性溶液中與BCA結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物。Lowry法與BCA法同屬于化學(xué)法。磺基水楊酸沉淀法屬于物理法，Bradford法屬于染料結(jié)合法，即考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中呈紅棕色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色深淺與蛋白濃度呈正比關(guān)系。
3．3 BCA法測(cè)定PEG-IL-6蛋白濃度及Bradford法測(cè)定變性液中蛋白濃度的結(jié)果分析
對(duì)Lowry法測(cè)得的IL-6樣品濃度為250 μg／mL，加入PEG修飾后再用BCA法測(cè)得的該樣品的濃度為246 μg／mL，說(shuō)明PEG對(duì)BCA法沒(méi)有影響。對(duì)BCA法測(cè)定的包涵體變性液中蛋白濃度為25 mg／mL的樣品用Bradford法測(cè)得只有1．59 mg／mL，對(duì)照試驗(yàn)顯示包涵體變性液中的β一巰基乙醇嚴(yán)重干擾BCA法，而對(duì)Bradford法無(wú)影響。由此可見(jiàn)，Bradford法適于檢測(cè)包涵體變性液。表2是連續(xù)10次對(duì)同一PEG-IL-6樣品用BCA法測(cè)定和同一包涵體變性液樣品用Bradford法測(cè)定的結(jié)果。
表2 BCA法測(cè)定PEG-IL-6和Bradford法測(cè)定包涵體變性液中蛋白濃度的重復(fù)性結(jié)果
4．1 蛋白濃度的測(cè)定范圍
按照文獻(xiàn)[4-7]所述方法操作，各種方法測(cè)定蛋白濃度的范圍如下：Lowry法標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度設(shè)置范圍為10～100 g／mL；BCA法標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度設(shè)置在20～ 1 000 g／mL時(shí)r值仍大于0．998；磺基水楊酸沉淀法標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度設(shè)置在50～500 g／mL時(shí)，r值才大于0．99，過(guò)高則產(chǎn)生的沉淀不易懸浮；Bradford法為31．25～2 000 g／mL。蛋白濃度測(cè)定方法的線性范圍取決于所加樣品中的蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與所加試劑中有效化學(xué)成分的摩爾數(shù)之比，而非體積之比，因此，可以通過(guò)減少樣品體積來(lái)提高檢測(cè)范圍的上限。
4．2 影響因素
影響Lowry法測(cè)定蛋白的主要因素有某些氨基酸、NH 、兼性離子緩沖液、非離子表面活性劑、蔗糖、含硫化合物；影響B(tài)CA法測(cè)蛋白的主要因素有蔗糖、NH4+、尿素、EDTA_7 J，磺基水楊酸沉淀法雖然克服了以上各種因素，但是不同的蛋白所形成的沉淀性質(zhì)差別很大。如本試驗(yàn)所顯示，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定破傷風(fēng)類(lèi)毒素和IL-6蛋白含量誤差可超過(guò)100％ ，且蛋白濃度越小誤差越大，因此用此法測(cè)定蛋白含量時(shí)應(yīng)選相同的或性質(zhì)相近的蛋白做標(biāo)準(zhǔn)。影響B(tài)radford法的主要因素有甘油、乙酸、去污劑和一些堿性緩沖系統(tǒng)。由于用Lowry法測(cè)定PEG-IL-6時(shí)會(huì)產(chǎn)生黃色沉淀，并且迅速沉淀到管底，無(wú)法用分光光度計(jì)測(cè)得均勻的吸光度。所以，測(cè)定PEG-IL-6等PEG化的蛋白濃度時(shí)不能采用Lowry法，但可以采用BCA法。包涵體的變性液和復(fù)性液中經(jīng)常會(huì)含有尿素和β．巰基乙醇，這些物質(zhì)會(huì)干擾BCA法的測(cè)定，所以BCA法不適于含有尿素和β．巰基乙醇的變性液中蛋白含量的測(cè)定。根據(jù)表1可知，磺基水楊酸沉淀法對(duì)每種樣品檢測(cè)偏差都較大，因此，沉淀法必須用與樣品同質(zhì)的已知蛋白含量的對(duì)照品測(cè)定，也不適于檢測(cè)PEG-IL-6和變性液蛋白測(cè)定。通過(guò)表2的結(jié)果顯示，BCA法檢測(cè)PEG-IL-6的干擾少重現(xiàn)性高(RSD<5％)，而B(niǎo)radford法可以不受變性液中的還原性物質(zhì)干擾，對(duì)包涵體變性液中的蛋白濃度的檢測(cè)比較準(zhǔn)確，且重現(xiàn)性好(RSD<5％)。因此，對(duì)于PEG-IL-6等PEG修飾后的蛋白濃度測(cè)定*好采用BCA法，而對(duì)于包涵體變性液這種含有還原性物質(zhì)的樣品，其蛋白濃度測(cè)定*好采用Bradford法。